Edição de genes
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Edição de genes , a capacidade de fazer mudanças altamente específicas no GOTA seqüência de um organismo vivo, essencialmente personalizando sua composição genética. A edição do gene é realizada usando enzimas , particularmente nucleases que foram projetadas para atingir uma sequência de DNA específica, onde introduzem cortes nas fitas de DNA, permitindo a remoção do DNA existente e a inserção de DNA de substituição. A chave entre as tecnologias de edição de genes é uma ferramenta molecular conhecida como CRISPR-Cas9, um poderoso tecnologia descoberto em 2012 pela cientista americana Jennifer Doudna, a cientista francesa Emmanuelle Charpentier e colegas e refinado pelo cientista americano Feng Zhang e colegas. O CRISPR-Cas9 funcionou com precisão, permitindo aos pesquisadores remover e inserir DNA nos locais desejados.
CRISPR-Cas9; edição de genes O complexo de edição de genes CRISPR-Cas9 da bactéria Streptococcus pyogenes . molekuul.be/Fotolia
O salto significativo nas ferramentas de edição de genes trouxe uma nova urgência para discussões de longa data sobre o ético e social implicações cercando oEngenharia genéticade humanos. Muitas questões, como se a engenharia genética deveria ser usada para tratar doenças humanas ou para alterar características como beleza ou inteligência, foram feitas de uma forma ou de outra por décadas. Com a introdução de fácil e tecnologias eficientes de edição de genes, particularmente CRISPR-Cas9, no entanto, essas questões não eram mais teóricas, e as respostas a elas teriam impactos muito reais na medicina e na sociedade.
Primeiras tentativas de corrigir erros genéticos
A ideia de usar edição de genes para tratar doenças ou alterar características data pelo menos dos anos 1950 e da descoberta da estrutura de dupla hélice do DNA. Na era da descoberta genética de meados do século 20, os pesquisadores perceberam que a sequência de bases no DNA é passada (principalmente) fielmente dos pais para os filhos e que pequenas mudanças na sequência podem significar a diferença entre saúde e doença. O reconhecimento deste último levou à conjectura inevitável de que com a identificação de erros moleculares que causam doenças genéticas viriam os meios para corrigir esses erros e, assim, possibilitar a prevenção ou reversão da doença. Essa noção foi a ideia fundamental por trásterapia de genese a partir da década de 1980 era visto como o santo graal da genética molecular.
O desenvolvimento de tecnologia de edição de genes para terapia genética, no entanto, se mostrou difícil. Muitos progressos iniciais focaram não na correção de erros genéticos no DNA, mas sim na tentativa de minimizar suas consequências, fornecendo uma cópia funcional do gene mutado. gene , seja inserido no genoma ou mantido como uma unidade extracromossômica (fora do genoma). Embora essa abordagem fosse eficaz para algumas condições, era complicada e de escopo limitado.
A fim de realmente corrigir os erros genéticos, os pesquisadores precisavam ser capazes de criar uma quebra de fita dupla no DNA precisamente no local desejado nos mais de três bilhões de pares de bases que constituir a genoma humano . Uma vez criada, a quebra de fita dupla pode ser reparada de forma eficiente pelo célula usando um modelo que direcionou a substituição da sequência ruim pela sequência boa. No entanto, fazer a quebra inicial precisamente no local desejado - e em nenhum outro lugar - dentro do genoma não foi fácil.
Quebrando DNA em locais desejados
Conheça a tecnologia CRISPR Cas9 na edição de genes e sua aplicação na terapêutica humana para a agricultura Examinando como os cientistas anexam a ferramenta molecular CRISPR-Cas9 a uma fita de RNA para editar genes e reparar sequências de DNA danificadas. Exibido com permissão de The Regents of the University of California. Todos os direitos reservados. (Um parceiro de publicação da Britannica) Veja todos os vídeos para este artigo
Antes do advento do CRISPR-Cas9, duas abordagens foram usadas para fazer quebras de fita dupla específicas do local no DNA: uma baseada em nucleases de dedo de zinco (ZFNs) e outra baseada em nucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcrição (TALENs). ZFNs são fusão proteínas composto de domínios de ligação de DNA que reconhecem e se ligam a sequências específicas de três a quatro pares de bases. Conferir especificidade a uma sequência alvo de nove pares de bases, por exemplo, exigiria três domínios ZFN fundidos em tandem. O arranjo desejado de domínios de ligação de DNA também é fundido a uma sequência que codifica uma subunidade da nuclease bacteriana Fok1. Facilitando um corte de fita dupla em um local específico requer a engenharia de duas proteínas de fusão ZFN - uma para se ligar em cada lado do local alvo, em fitas opostas de DNA. Quando ambas as ZFNs estão ligadas, as subunidades Fok1, estando em proximidade, ligam-se umas às outras para formar um dímero ativo que corta o DNA alvo em ambas as fitas.
As proteínas de fusão TALEN são projetadas para se ligarem a sequências de DNA específicas que flanqueiam um local alvo. Mas, em vez de usar domínios de dedo de zinco, os TALENs utilizam domínios de ligação a DNA derivados de proteínas de um grupo de patógenos de plantas. Por razões técnicas, os TALENs são mais fáceis de projetar do que os ZFNs, especialmente para sites de reconhecimento mais longos. Semelhante aos ZFNs, os TALENs codificam um domínio Fok1 fundido à região de ligação ao DNA projetada, então, uma vez que o local alvo é ligado em ambos os lados, a nuclease Fok1 dimerizada pode introduzir uma quebra de fita dupla no local de DNA desejado.
Ao contrário de ZFNs e TALENs, CRISPR-Cas9 usa RNA -Ligação de DNA, em vez de ligação de proteína-DNA, para orientar a atividade de nuclease, o que simplifica o projeto e permite a aplicação a uma ampla gama de sequências alvo. CRISPR-Cas9 foi derivado dos sistemas imunológicos adaptativos de bactérias . O acrônimo CRISPR refere-se a c lustroso r uniformemente eu espaçado s hort p alindrômico r epeats, que são encontrados na maioria dos genomas bacterianos. Entre as curtas repetições palindrômicas estão trechos de sequência claramente derivados dos genomas de patógenos bacterianos. Espaçadores mais antigos são encontrados na extremidade distal do cluster, e espaçadores mais novos, representando patógenos encontrados mais recentemente, são encontrados perto da extremidade proximal do cluster.
Transcrição da região CRISPR resulta na produção de pequenos RNAs guia que incluem formações em grampo das repetições palindrômicas ligadas a sequências derivadas dos espaçadores, permitindo que cada um se ligue ao seu alvo correspondente. O heteroduplex de RNA-DNA formado então se liga a uma nuclease chamada Cas9 e a direciona para catalisar a clivagem do DNA de fita dupla em uma posição próxima à junção da sequência específica do alvo e a repetição palindrômica no RNA guia. Como os heteroduplexes de RNA-DNA são estáveis e porque o projeto de uma sequência de RNA que se liga especificamente a uma sequência de DNA alvo única requer apenas o conhecimento das regras de emparelhamento de bases de Watson-Crick (a adenina se liga à timina [ou uracila no RNA] e a citosina se liga a guanina), o sistema CRISPR-Cas9 era preferível aos projetos de proteína de fusão necessários para o uso de ZFNs ou TALENs.
Outro avanço técnico veio em 2015, quando Zhang e colegas relataram a aplicação de Cpf-1, em vez de Cas9, como a nuclease emparelhada com CRISPR para conseguir a edição de genes. Cpf-1 é uma nuclease microbiana que oferece vantagens potenciais sobre Cas9, incluindo a necessidade de apenas um RNA guia CRISPR para especificidade e fazer cortes escalonados (em vez de rombos) de DNA de fita dupla. As propriedades de nuclease alteradas deram potencialmente maior controle sobre a inserção de sequências de DNA de substituição do que era possível com Cas9, pelo menos em algumas circunstâncias. Os pesquisadores suspeitam que as bactérias abrigam outras proteínas de edição do genoma também, o diversidade dos quais poderia ser valioso para refinar ainda mais a precisão e versatilidade das tecnologias de edição de genes.
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