Cromatografia de eluição
Esse método, empregado com colunas, envolve a migração do soluto por todo o sistema e a detecção do soluto conforme ele emerge da coluna. O detector monitora continuamente a quantidade de soluto no fluxo de fase móvel emergente - o eluato - e transduz o sinal, na maioria das vezes para uma tensão, que é registrada como um pico em um registrador gráfico. O traço do registrador onde o soluto está ausente é a linha de base. Um gráfico da concentração de soluto ao longo da coordenada de migração dos cromatogramas de desenvolvimento produz um pico de soluto semelhante. Coletivamente, os gráficos são os perfis de concentração; idealmente, são gaussianas (curvas normais, em sino ou de erro). A intensidade do sinal também pode ser digitalizada e armazenada em um Memória do computador para lembrar mais tarde. O comportamento do soluto é relatado em termos do tempo de retenção, que é o tempo necessário para um soluto migrar, ou eluir, da coluna, medido a partir do instante em que a amostra é injetada no fluxo de fase móvel até o ponto em que o pico máximo ocorre. O tempo de retenção ajustado é medido a partir do aparecimento de um soluto não retido na saída. A dependência desses tempos na taxa de fluxo é removida relatando os volumes de retenção, que são calculados como os tempos de retenção multiplicados pela taxa de fluxo volumétrico da fase móvel.
cromatografia de eluição Parâmetros de formato do pico, largura do pico e altura da placa na cromatografia de eluição. Encyclopædia Britannica, Inc.
As manchas no leito plano desenvolvido, a série de picos no papel produzidos pelo registrador ou a impressão dos dados do computador são várias formas de cromatogramas.
Mecanismo de retenção
A classificação em termos do mecanismo de retenção é aproximada, porque a retenção na verdade é uma mistura de mecanismos. Se o coeficiente de partição for constante conforme a quantidade de soluto varia, a separação é chamada de cromatografia linear. Esta condição é altamente desejável porque as zonas de soluto se aproximam de distribuições gaussianas simétricas. Se o sistema for não linear, as zonas de soluto serão assimétricas. No caso assimétrico mais comum, uma zona cai em uma zona de soluto seguinte para contaminá-la.
Em soluto de cromatografia de adsorção moléculas ligar-se diretamente à superfície da fase estacionária. As fases estacionárias podem conter uma variedade de adsorção sítios que diferem na tenacidade com que se ligam às moléculas e em sua abundância relativa. O efeito líquido determina a atividade adsorvente. A cromatografia de partição utiliza um material de suporte revestido com um líquido de fase estacionária. Os exemplos são (1) água retida por celulose, papel ou sílica, ou (2) um filme fino revestido ou ligado a um sólido . O suporte sólido idealmente é inativo na retenção de solutos, mas na verdade não é; a retenção é principalmente devida à solução de soluto na fase líquida estacionária.
Como mencionado acima, a fase estacionária na cromatografia de exclusão de tamanho consiste em moléculas da fase móvel aprisionadas na estrutura porosa de um sólido. As moléculas de soluto são retidas quando se difundem para dentro e para fora desses poros. O tempo que permanecem nos poros é função do seu tamanho, que determina a profundidade de penetração. Existe um certo tamanho molecular que representa o caso recém-excluído. Moléculas deste tamanho e maiores são excluídas dos poros e não são separadas. Eles aparecem primeiro na cromatografia de eluição. Na outra extremidade do espectro de tamanho, há um certo tamanho para o qual todas as moléculas dessa magnitude e menores penetram em todos os poros. Essas moléculas também não são separadas; eles eluem por último. A cromatografia de filtração em gel refere-se a métodos de exclusão por tamanho que empregam água como fase móvel; a cromatografia de permeação em gel faz uso de uma fase móvel orgânica.
Interações intermoleculares muito específicas, fechadura e chave, são conhecidas em bioquímica. Exemplos incluem enzimas proteína , ligação antígeno - anticorpo e hormônio - receptor. Uma característica estrutural de uma enzima se ligará a uma característica estrutural específica de uma proteína. A cromatografia de afinidade explora esse recurso ligando-se a um ligando com a capacidade interativa desejada para um suporte, como um gel usado em cromatografia de filtração em gel. O ligante retarda um soluto com a característica estrutural compatível e passa todos os outros solutos na mistura. O soluto é então eluído por uma mudança de fase móvel, como incorporar um soluto competidor, mudar a acidez ou mudar a força iônica do eluente.
Não há fase estacionária no fracionamento de fluxo de campo; os fluxos ou camadas de velocidades diferentes da fase móvel com o soluto distribuído entre eles produzem a separação.
Fases
Cromatografia em fase gasosa
A classificação por fases fornece o estado físico da fase móvel seguido pelo estado da fase estacionária. A cromatografia gasosa que emprega um fluido gasoso como fase móvel, chamada de gás portador, é subdividida em cromatografia gás-sólido e cromatografia gás-líquido. Os gases transportadores usados, como hélio , hidrogênio e nitrogênio têm interações intermoleculares muito fracas com solutos. As peneiras moleculares são usadas em cromatografia de exclusão de tamanho de gás aplicada a gases de baixo peso molecular . A adsorção em sólidos tende a gerar sistemas não lineares. A cromatografia gás-líquido emprega uma fase estacionária líquida onde as forças da solução fornecem retenção. Em pressões normais, os solutos na fase gasosa se comportam como uma mistura de gases ideais. Todas as interações responsáveis pela retenção seletiva ocorrem na fase estacionária. Assim, uma grande variedade de fases estacionárias líquidas tem sido empregada; centenas foram relatados.
Uma regra básica em química orgânica é que semelhante se dissolve semelhante. Assim, o solvente polar água dissolve o etanol do soluto polar, mas não o Hidrocarbonetos octano. O solvente não polar benzeno dissolve o octano, mas não o etanol. As fases estacionárias polares reterão os solutos polares e passarão pelas não polares. A ordem de emergência é invertida com fases estacionárias não polares. Lutz Rohrschneider, da Alemanha, iniciou estudos que levaram a um conjunto padrão de espécies de soluto, sondas de solvente, que ajudaram a ordenar fases estacionárias em termos de polaridade e interações intermoleculares presentes.
Na cromatografia gasosa, a retenção de solutos é mais freqüentemente referida ao comportamento dos hidrocarbonetos de cadeia linear; isto é, volumes de retenção relativos são usados. Em uma escala logarítmica, isso se torna o índice de retenção (RI) apresentado pelo químico suíço Ervin sz. Kováts. Os valores RI das sondas de solvente servem como base para o método de classificação introduzido por Rohrschneider. Esquemas semelhantes foram sugeridos para sistemas líquidos.
Interações intermoleculares de fase gasosa ocorrem e são exploradas na cromatografia de fluido supercrítico. Exemplos de gases interativos usados em alta pressão são dióxido de carbono , óxido nitroso , amônia , hidrocarbonetos, enxofre hexafluoreto, e halogenado metanos .
Misturas de solutos que têm uma ampla ponto de ebulição ou faixa de polaridade ou ter uma grande variedade de grupos funcionais representam um problema específico. Em baixas temperaturas de operação da coluna, os solutos com alta volatilidade (ou, mais precisamente, solutos com um grande valor numérico para o coeficiente de atividade da solução líquida) aparecem no início do cromatograma como picos bem resolvidos. Os solutos com baixa volatilidade progridem lentamente pela coluna, com ampla oportunidade para o alargamento do pico. Esses solutos aparecem como picos largos e muito baixos que podem passar despercebidos. Um aumento na temperatura da coluna aumenta a concentração dos solutos na fase gasosa. Os solutos de alta volatilidade, entretanto, passando agora a maior parte do tempo na fase de gás móvel, migram rapidamente através da coluna para aparecer como picos não resolvidos. Os solutos seguintes são resolvidos de forma adequada. Isso é denominado problema geral de eluição. Uma solução simples é aumentar a temperatura da coluna durante o curso da separação. Os solutos bem resolvidos e altamente voláteis são removidos da coluna em temperaturas mais baixas antes que os solutos de baixa volatilidade deixem a origem na entrada da coluna. Esta técnica é denominada cromatografia gasosa com temperatura programada.
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